蛋白质的变性与凝结 |
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| http://www.jk21.com 蛋白质 2005年9月15日编缉 |
蛋白质的分子表面上有大量各种极性基团，它们强烈吸引水分子，使溶液中的蛋白质成为高度水化的分子。直接吸附在蛋白质分子表面的水分子结合得最牢固，称为结合水，其数量约为蛋白质量的20%～50%，吸附在外层的水分子数量更多，但结合较松散。蛋白质的水化使它在溶液中有很高的稳定性，是典型的亲水胶体。
另一方面，蛋白质在多种条件下会发生胶凝作用，形成体积相当大的内部有很多空腔并包容着大量液体的软胶状物体。常见的例子如鸡蛋(整个或打开)受热时整体凝固，少量的蛋白质将大量的水分子包围在一起凝固，不能再流动。
蛋白质的凝固通常是在发生变性作用(denaturation)以后产生的。蛋白质在多种情况下会发生变性，加热和多种物理、化学、或机械处理都可能使蛋白质发生变性作用，使蛋白质的分子结构变成松散的无定形结构，分子中的活性基团更多暴露，化学活性增强，较易发生各种化学反应和凝结作用。
变性蛋白质的凝结与多种条件有关，通常在等电点的pH下比较完全。我们曾进行三次试验，将蔗汁加热到70℃下加亚硫酸到不同的pH值过滤，测定滤汁的含氮量(mg/L，混合汁为600)，结果如下表。
实验1 滤汁pH 4.9 4.3 3.7 3.3
滤汁含氮量 400 360 340 360
实验2 滤汁pH 6.4 4.8 4.3 3.7
滤汁含氮量 530 440 370 260
实验3 滤汁pH 6.3 4.9 4.3 3.5
滤汁含氮量 390 340 310 270
这些数据说明，在pH3.5～3.7间，滤汁的含氮量最低，即蛋白质的的凝结最完全。在等电点下，蛋白质大分子中的正电基和负电基的数量相等，处于等电状态。此时大分子中两种带电基团的数量都很大(绝不是不带电)。蛋白质分子间相反电荷的基团互相吸引并结合，形成大量的离子键，就将许多蛋白质分子联结和聚集起来，凝聚率达到最大值。
在pH高于等电点时，蛋白质带负电。此时它能与各种二价(或多价)阳离子结合而凝聚。钙镁盐有此作用，蔗汁在加灰至微酸性或中性时加热，蛋白质的凝结即是带负电的蛋白质与钙镁离子结合产生的。如果将蔗汁中的钙镁离子完全除去(例如加入相应的络合剂EDTA将汁中原有的这些离子消除)，则在pH５以上加热并没有凝结物析出
甜菜汁中蛋白质的情况类似。苏联西林博士和捷克瓦沙特科院士等对此进行了深入研究，阐明它们在不同条件下凝结的基本规律如下：
1. 如溶液中没有Ca2+，则蛋白质在pH2～4时凝聚得最好，这是等电凝聚。在pH4以上完全不产生凝聚作用。
2. 在溶液中存有Ca2+而没有糖的情况下，蛋白质在酸性下凝聚，但在碱性下凝聚得更好，在pH10以上都很好。此时的凝聚物带负电，是蛋白质和钙的结合体，并不是等电凝聚。
3. 在含Ca2+的糖液中，蛋白质凝聚的最佳pH为2～4和10～11，pH高于11.5 时凝聚变差，已形成的凝聚物亦会部分或全部复溶。这是由于在高pH下钙与蔗糖结合成为很稳固的络合物，溶液中缺乏游离的钙离子。
在通常的蔗汁澄清方法中，就是依靠钙离子的作用以及磷酸钙、亚硫酸钙沉淀物的吸附作用来除去蔗汁中的蛋白质，加热促进了这些作用。在甘蔗新鲜和处理正常时，蛋白质的除去率也是较高的，但在榨季后期则较低。普通亚硫酸法澄清在榨季不同时期的蛋白质除去率的测定结果如下表。
日期 20/12 10/1 18/1 7/2 15/3 12/4 14/5
蛋白质除去率 % 83.8 69.1 65.0 76.4 67.5 53.3 32.4
在三月及以前，蛋白质的除去率都高于60%，但四月以后就明显降低。这种情况说明，甘蔗在过了成熟期以后，蛋白质逐渐水解，分子量降低，水溶性增强；或蛋白质发生其他化学变化形成较难凝结的物质，使澄清时除去的百分率降低。甘蔗收割后放置时间较长、以及受台风吹折倒伏或受霜冻而死亡的甘蔗亦有类似情况。
重金属离子与蛋白质结合的作用比钙镁离子强很多。醋酸铅(特别是在碱性下)能使绝大部分蛋白质(以及其他带负电的亲水胶体)凝聚沉淀。硫酸铜亦善于和蛋白质结合凝聚，因此在通用的化学分析方法中，用硫酸铜在碱性下将蛋白质凝结而分离。
在蔗汁澄清过程中，蛋白质的凝结作用是有利的，它可以将各种分散的、幼细的悬浮微粒凝聚形成较结实粗大的沉淀颗粒，提高沉降速度和清汁的清度。因此，蛋白质含量高的新鲜蔗汁的澄清性能是较好的。过去有些生产红糖的工厂，在蔗汁中加入豆浆再加灰加热，可使清汁较清亮透明。在制造冰糖时，也要在糖液中加入豆浆(最早是加鸡蛋白液)加热，将糖液中的微细粒子凝聚除去。Chang研究原糖的回溶糖浆用大豆粉浆作澄清剂，它可以除去糖浆中的悬浮微粒，还可以除去部分色素。在加入豆粉对原糖量分别为0.1%、0.4%和0.8%时，脱色率分别为10%、38%和50%。他的研究说明，在中性附近豆粉蛋白质的凝结是和钙离子结合产生的，没有钙离子就不能凝结。
蔗汁澄清时蛋白质在中性附近的凝结也同时除去了不少色素。如果先将热蔗汁在pH4左右过滤除去蛋白质，然后再加灰至中性过滤，滤汁的色泽要比直接加灰至中性过滤的深很多。这是因为蛋白质在酸性的凝结物很浅色(此时很少色素沉出)，随后在中性下过滤时又缺乏蛋白质凝结物，故除去色素少。在中性附近，蛋白质可以和植物鞣质(性质类似单宁)结合，两者一起凝结析出，故滤汁的色泽较浅。蛋白质和单宁的结合是熟知的，此作用在酸性下减弱。
甘蔗过了成熟期以后，以及不新鲜的或风折、霜冻的甘蔗，蔗汁中蛋白质的含量特别是可凝结的蛋白质减少，澄清处理时沉淀物的凝聚情况较差，导致分散悬浮的微粒增加，清汁色泽较深；加入少量豆浆可以明显改善这种状况。我们曾进行试验，将已砍下很长时间、变红发酸的甘蔗榨出蔗汁(其纯度低于60)，加灰加热，沉淀物很微细，汁很混浊，澄清效果极差。但如先加入少量豆浆再加灰加热，杂质凝聚情况明显改善，清汁亦较清亮。
蔗汁中的蛋白质，在澄清过程中只除去了一部分，还有相当数量遗留在清汁中，即用高效率的清净脱色，也难以将它们完全除去。这些残留在糖汁中的蛋白质，仍然保留胶体物质的性质，它会增大糖汁的粘度和增加过滤困难，并在随后的生产过程中参与和加速还原糖分解的反应，加深糖品色泽；进入糖蜜后还会影响糖蜜变质。它们未起到有益的作用反而变成了“有害氮”化合物。
克拉克等多位专家的大量研究说明，在精炼糖中也含有微量的蛋白质，它和多糖类一起，是造成酸性饮料在存放时形成絮状物的主要原因。这些絮状物中含蛋白质4%～5%。美国Godshall等分析了10多个精糖样本，它们含蛋白质0.01～0.13mg/kg，在多个原糖样本中含0.7～1.3mg/kg。在精炼糖过程的各种物料中，含0.06～0.6mg/kgBx的蛋白质。
总之，蛋白质的凝结有利于蔗汁的澄清，但蔗汁中的蛋白质并没有在澄清时完全凝结，而残留的蛋白质是不利于制糖生产的。
因此，糖汁澄清时蛋白质为甚么不能完全凝结？如何使之凝结得更完全？是很值得进一步深入探讨的问题。
蛋白质的凝结是在变性以后发生的。蛋白质在很多情况下会发生变性作用。热变性是最常见的，一般在60℃以上就相当快。强烈的机械搅拌、震荡、鼓泡；以及超声波、紫外线或放射性照射等，都会使蛋白质变性。较强的酸或碱，重金属如铅、铜的化合物亦使蛋白质变性；某些有机物如甲醛、乙醇、丙酮、三氯乙酸、尿素、洗涤剂、季铵盐等也有此作用。
蛋白质的变性作用主要是它的分子结构发生变化。天然的蛋白质的分子结构紧密、按严格的规则排列，因此多种蛋白质可以形成结晶体。蛋白质变性以后，分子结构转变为松散的无定形结构，不再能结晶，并失去原有的生物活性；分子中各种活性基团比较暴露，化学活性增强，参加各种化学反应的能力增大，较易凝结析出。
蛋白质变性凝结后，它和水结合的能力变化不大，并没有明显的脱水作用。如所周知，一只完整的鸡蛋加热凝结以后，原来可以流动的液态物质整体变成了固态，并没有一点水被“脱”出来。而且相反，占比例不大的蛋白质分子把很大量的液体牢固地包藏在凝结物之内。
蛋白质凝结物的体积相当庞大，重量只约为糖汁的百分之一的凝结蛋白质在沉淀以后可占到10%以上的体积。如果蛋白质被脱水，例如加入酒精，所生成的沉淀物的体积是很小的。
在生物化学中知道，有些蛋白质是不能加热凝结的。不少生物体中有一类蛋白质称为糖蛋白(或粘蛋白)，它是葡萄糖等单糖或多糖及它们的衍生物与蛋白质的化合物。它不易变性，加热时也不凝固(有些在100℃下加热１小时也不变性凝结)。据此可以将这类蛋白质和其他蛋白质分离。在生物体以外，蛋白质能和多糖结合形成稳定程度不同的化合物，特别是含羧基的多糖易于和蛋白质的正电基结合，蛋白质中的酪氨酸和精氨酸部分亦易和糖类结合。这类蛋白质的粘度很高(特别是含有多糖体者)，亦称为粘蛋白 (mucoprotein)。
同时，有几类物质会减弱蛋白质的变性凝结作用，糖类、高分子脂肪酸、磷酯等都有这种效应。在葡萄糖或果糖的饱和溶液中，蛋白质在加热时并不变性。在不同浓度的蔗糖液中，蛋白质受热凝聚的比率随蔗糖浓度升高而下降，如在含蔗糖14%的溶液中加热，蛋白质的不凝结量比在水中加热时多12.7%。蔗糖并不改变蛋白质的热凝与pH 及有关条件的关系，但却降低了凝聚率、并使凝聚物变得较松散，体积和粘性增大。我们的试验说明，将蔗汁在pH3.8下的凝聚物分离出来，分别置于水和糖液中加热，在水中的凝聚物紧密结实，容易过滤，而在糖液中的凝聚物松散而粘稠，难过滤。蔗糖对蛋白质的这种“保护作用”，在生物化学中被利用来防止或减慢蛋白质的变性。
Bennett的研究发现，某些蔗汁含较多淀粉，加热到60℃后淀粉糊化，就会明显减弱蛋白质在等电点下凝聚的作用。一些长期在干旱下生长的甘蔗，含有较多的酸性多糖体，它和蛋白质相作用使蛋白质的等电点大幅度降低(如降到2.1)，并较难凝聚。
蔗汁和甜菜汁中的蛋白质的等电点为3～4，澄清过程不能利用它来使蛋白质凝结(以免蔗糖转化)。澄清处理在中性或碱性下进行，蛋白质都是带负电的，主要依靠钙离子和钙盐沉淀物的作用来使蛋白质凝结，碳酸法在强碱性下处理并生成大量的碳酸钙沉淀，使蛋白质凝结的效果优于亚硫酸法。
蛋白质在上述情况下发生的变性作用有共通之处，但也有强弱不同的差别，以及随后的不同变化。加入乙醇、重金属能使绝大多数蛋白质凝结沉淀，其他处理的作用相对较弱。
糖厂现行的澄清处理方法，有相当部分的蛋白质未能凝结除去(特别是在蔗汁不新鲜时)，在后工序产生多种不良影响，应当研究改进这种状况，探索新的方法。可能的途径是相当多的。将糖汁中的蛋白质更完全地变性凝结，可以显著地改善糖汁澄清过程和随后的工序，提高蔗糖晶体的质量和结晶速度，降低糖蜜粘度，加速分蜜，减少制炼过程中的各种有害化学反应。这是一个值得大力研究和很有希望突破的重要课题。
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